Proyecto final de Grado: Estudio de la relevancia funcional de HIWI2 en la diferenciación de cardiomiocitos a partir de células madre pluripotentes humanas
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2023
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Resumen
Las proteínas PIWI fueron descubiertas hacia finales de la década de 1990 en tejido extraído de las gónadas de Drosophila melanogaster (mosca de la fruta), y se las identificó como proteínas reguladoras de procesos vinculados con la línea germinal, pero estudios recientes han comenzado a explorar también su rol en contextos somáticos. Forman parte de la familia de proteínas Argonauta, altamente conservada entre especies, incluyendo a los humanos. De las cuatro proteínas humanas homólogas PIWI, conocidas como proteínas HIWI, este proyecto se enfoca en HIWI2 (también llamada PIWIL4). Al momento de la redacción de este documento, es la única de las cuatro que se encuentra reportada en la literatura como una proteína que participe en los procesos de diferenciación de células madre pluripotentes humanas hacia linajes de células somáticas, siendo estos los linajes neuronal y osteoblástico. Coincidentemente, en un trabajo previo realizado en el propio laboratorio LIAN (Fleni-CONICET) y publicado en 2020 [1], se estudió el perfil de expresión de genes HIWI a lo largo del proceso de diferenciación de células madre embrionarias humanas hacia el linaje cardíaco. Entre sus resultados, reportaron que el transcripto de HIWI2 presenta un nivel de expresión creciente, dejando planteada la posibilidad de que ejerza algún tipo de función en dicho proceso. Como objetivo general de este proyecto se propuso estudiar el grado de participación de la proteína HIWI2 en la diferenciación in vitro de cardiomiocitos a partir de células madre pluripotentes inducidas (iPSCs) humanas, para lo cual se generó una línea de iPSCs mutantes que porten una alteración en el gen HIWI2 que haga inviable la correcta expresión de su proteína. Esto se llevó a cabo mediante edición genética basada en el sistema CRISPR-Cas9, realizando todos los pasos que comprenden desde la fase bioinformática del diseño de los guías CRISPR, la fase de preparación de las herramientas de edición genética (plásmidos), incluyendo trabajo con bacterias; y finalmente el uso de dichos plásmidos para transfectar las iPSCs, seguido de un proceso de selección para lograr identificar y aislar un clon que hubiera adquirido la mutación deseada. La línea de iPSCs HIWI2 knockout heterocigota (HIWI2+/−) obtenida fue luego diferenciada a cardiomiocitos, en paralelo a una línea de iPSCs wildtype como referencia. Se evaluó la expresión de HIWI2 y se estudió el efecto de su ausencia a lo largo de los diferentes estadios del proceso de diferenciación. Esta caracterización incluyó análisis morfológico mediante microscopia de campo claro, un ensayo funcional de electroestimulación, y evaluación de la expresión de marcadores relevantes mediante RT-qPCR, microscopía de fluorescencia, y citometría de flujo. Los resultados de este proyecto sugieren que las iPSCs HIWI2+/− pueden ser diferenciadas a cardiomiocitos, pero que estos no presentan actividad contráctil espontánea y tampoco puede ser inducida mediante electroestimulación externa. Esto, sumado a una alteración significativa en la expresión de múltiples genes que codifican proteínas del sarcómero o que participan del transporte iónico, sugiere un compromiso de su capacidad contráctil. Por lo tanto, los resultados de este proyecto son consistentes con que HIWI2 efectivamente esté involucrada en el proceso de diferenciación de células madre pluripotentes hacia el linaje cardíaco.
Descripción
Palabras clave
CÉLULAS MADRE, MIOCITOS CARDÍACOS, DIFERENCIACIÓN, HIWI2, PROTEÍNAS